Tests cellulaires

Tests cellulaires

Introduction

L'autophagie est une voie de dégradation lysosomale du matériel cytoplasmique, qui est activée dans des conditions de stress telles que la privation d'acides aminés ou une infection virale. Les cellules de mammifères utilisent l'autophagie pendant de courtes périodes de famine pour dégrader les composants cellulaires non essentiels afin de libérer des nutriments pour les réactions vitales de biosynthèse. Des résultats récents ont montré que l'autophagie contribue également au développement, à la régulation de la croissance et au cancer, ainsi qu'à la longévité. Après induction par un signal de stress tel que la privation d'acides aminés, la première étape de l'autophagie est la formation d'un autophagosome. Une protéine marqueur d'autophagosome bien connue, MAP LC3, a été identifiée à l'origine comme une protéine associée aux microtubules et nommée "microtubule-associated-proteinlight-chain-3" (protéine de lumière associée aux microtubules-3). LC3 est une petite protéine de 16 à 18 kDa qui est soluble dans les cellules non affamées, mais qui devient associée à la membrane périphérique en cas de privation d'acides aminés. La microscopie immunoélectronique a montré que LC3 s'associe aux membranes limitantes internes et externes des autophagosomes et que l'association membranaire est médiée par une conjugaison covalente à un lipide, la phosphatidyléthanolamine. Dans les Western blots, deux formes de LC3 sont observées, LC3-I et LC3-II. LC3-I se trouve dans la fraction soluble et LC3-II dans la fraction membranaire pelletable. Les deux formes de LC3-I et LC3-II sont observées dans les cellules non affamées, mais pendant l'induction de l'autophagie, la proportion de LC3-II augmente. Le kit ELISA Autophagy (LC3-II Quantitation) de Cell Biolabs est un essai immunoenzymatique développé pour la détection et la quantification de LC3 dans des échantillons de lysats cellulaires. Le kit utilise une procédure de perméabilisation sélective pour éliminer le pro-LC3 cytosolique et le LC3-I et conserver le LC3-II lié à la membrane de l'autophagosome (figure 1). La quantité de LC3-II dans un échantillon de lysat inconnu est déterminée en comparant son absorbance à celle d'une courbe standard connue de LC3. Chaque kit contient suffisamment de réactifs pour réaliser jusqu'à 96 tests, y compris la courbe standard et les échantillons inconnus.

Produits apparentés

1. CBA-401 : Vecteur d'expression GFP-LC3

2. CBA-5115 : Kit d'immunoblot pour l'autophagie (détection de LC3-II)

3. CBA-5117 : Kit ELISA pour l'autophagie cellulaire (quantification de LC3-II)

Composants du kit

Boîte 1 (expédiée à température ambiante)

1. Plaque revêtue d'anticorps anti-LC3 (référence 51161B) : Une plaque à 96 puits (8 x 12).

2. 100X Réactif d'élimination du LC3 cytosolique (Part No. 51151A) : Un tube de 1 ml

3. Anticorps anti-LC3 (référence 51162C) : Un tube de 50 µl d'anticorps anti-LC3.

4. Anticorps secondaire, conjugué HRP (1000X) (référence 230003) : Un flacon de 20 µl.

5. Diluant pour essai (référence 310804) : Un flacon de 50 ml.

6. Tampon de lavage 10X (référence 310806) : Un flacon de 100 ml.

7. Solution de substrat (référence 310807) : Un flacon ambré de 12 ml.

8. Solution d'arrêt (référence 310808) : Un flacon de 12 ml.

Boîte 2 (expédiée sur des blocs de glace bleus)

1. Standard LC3 recombinant (référence 51163D) : Un tube de 100 µL de 1,0 μg/mL de LC3 recombinant dans du TBS plus BSA.
 

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