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Protocole pour le western blot

Protocole pour le western blot

 

Matériel requis
 
Préparation et séparation des protéines par électrophorèse
 
  1. Déterminer la concentration protéique contenu dans chaque échantillon
  2. Prélever par exemple 20 µg de protéines et ajouter le Laemmli
  3. Placer les échantillons 5 minutes à 95°C puis centrifuger
  4. Charger le même volume de protéines dans chacun des puits du gel d'acrylamide (le%en acrylamide du gel dépend de la taille de la protéine d'intérêt) avec un puits contenant le marqueur de poids moléculaire
  5. Migration à ampérage constant dans la cuve contenant le tampon de migration

Transfert des protéines
 
  1. Placer le gel en sandwich avec une membrane de PVDF / nitrocellulose en chassant les bulles présentent entre le gel et la membrane.
  2. Transférer à voltage constant dans la cuve contenant le tampon de transfert


Incubation de l'anticorps et révélation
 
  1. Placer la membrane dans le rouge Ponceau pour vérifier la qualité du transfert des protéines
  2. Rincer la membrane et la placer en solution de blocage
  3. Incuber avec l'anticorps primaire une nuit à 4°C
  4. Rincer la membrane
  5. Incuber avec l'anticorps secondaire
  6. Rincer la membrane
  7. Appliquer la solution de révélation